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无菌室标准化技术要求

发布日期:[2019-04-10 11:49:26]来源: 共阅[ ]次

一、目的

旨在为无菌操作及无菌室的保护提供一个标准化规程。

二、适用范围

生测实验室。

三、责任者

QC主管生测员

四、安全注意事项

严格无菌操作,防止微生物污染;操作人员进入无菌室应先关掉紫外灯。

五、规程

1. 无菌室应设有无菌操作间和缓冲间,无菌操作间洁净度应达到10000级,室内温度保持在2024℃,湿度保持在45%~60%。超净台洁净度应达到100级。

2. 无菌室应保持清洁,严禁堆放杂物,以防污染。

3. 严防一切灭菌器材和培养基污染,已污染者应停止使用。

4. 无菌室应备有工作浓度的消毒液,如质量分数为5%的甲酚溶液,质量分数为70%的酒精,质量分数为0.1%的新洁尔灭溶液等。

5. 无菌室应定期用适宜的清毒液灭菌清洁,以保证无菌室的洁净度符合要求。

6. 需要带入无菌室使用的仪器、器械、器皿等一节物品,均应包扎严密,并应经过适宜的方法灭菌。

7. 工作人员进入无菌室前,必须用肥皂或消毒液洗手消毒,然后在缓冲间更换专用工作服、鞋、帽子、口罩和手套(或用质量分数为70%的乙醇再次擦试双手),方可进入无菌室进行操作。

8. 无菌室使用前必须打开无菌室的紫外灯辐照灭菌30min以上,并且同时打开超净台进行吹风。操作完毕,应及时清理无菌室,再用紫外灯辐照灭菌20min。

9. 供试品在检查前,应保持外包装完整,不得开启,以防污染。检查前,用质量分数为70%的酒精棉球消毒外表面。

10. 每次操作过程中,均应做阴性对照,以检查无菌操作的可靠性。

11. 吸取菌液时,必须用吸耳球吸取,切勿直接用口接触吸管。

12. 接种针每次使用前后,必须通过火焰灼烧灭菌,待冷却后,方可接种培养物。

13. 带有菌液的吸管、试管、培养皿等器皿应浸泡在盛有质量分数为5%的来苏尔溶液的消毒桶内消毒,24h后取出冲洗。

14. 如有菌液洒在桌上或地上,应立即用质量分数为5%的石炭酸溶液或质量分数为3%的来苏尔倾覆在被污染处至少30min,再作处理。工作衣帽等受到菌液污染时,应立即脱去,高压蒸汽灭菌后洗涤。

15. 凡带有活菌的物品,必须经消毒后,才能在水龙头下冲冼,严禁污染下水道。

16. 无菌室应每月检查菌落数。在超净工作台开启的状态下,取内径90mm的无菌培养皿若干,无菌操作分别注入融化并冷却至约45℃的营养琼脂培养基约15mL。放至凝固后,倒置于30~35℃培养箱培养48h,证明无菌后,取平板3~5个,分别放置工作位置的左、中、右等处。开盖暴露30min后,倒置于30~35℃培养箱培养48h,取出检查。100级洁净区平板杂菌数平均不得超过1个菌落,10000级洁净室平均不得超过3个菌落。如超过限度,应对无菌室进行彻底消毒,直至重复检查合乎要求为止。

六、无菌室技术指导说明

在获得了无菌环境和无菌材料后,还要保持无菌状态,才能对某种特定的已知微生物进行研究或利用它们的功能,否则外界的各种微生物很容易混入。外界不相干的微生物混入的现象,在微生物学中我们叫做污染杂菌。防止污染的微生物学工作中十分关键的技术。一方面是彻底灭菌,另一方面防止污染,这是无菌技术的两个方面。另外,还要防止所研究的策生物,物别是致病微生物或经过基因工程改造了的本来自然界不存在的微生物从实验容器中逃逸到外界环境中去。因此,在微生物学中,采取以下措施:

1. 无菌室一般是在微生物实验室内专辟一个小房间,可以用板材和玻璃建造。面积不宜过大,4~5m2即可,高2.5m左右。

2. 无菌室外要设一个缓冲间,缓冲间的门和无菌室的门不要朝向同一方向,以免气流带进杂菌。无菌室和缓冲间都必须密闭。室内装备的换气设备必须有空气过滤装置。无菌室内的地面、墙壁必须平整,不易藏污纳垢,便于清洗。工作台的台面应该处于水平状态。无菌室和缓冲间都装有紫外线灯,无菌室的紫外线灯距离工作台面1m。工作人员进入无菌室应穿灭过菌的服装,戴帽子。

3. 当前无菌室多存在于微生物工厂。一般实验室则使用超净台。超净台其主要功能是利用空气层流装置排除工作台面上部包括微生物在内的各种微小尘埃。通过电动装置使空气通过高效过滤器后进入工作台面,使台面始终保持在流动无菌空气控制之下。而且在接近外部的一方有一道高速流动的气帘防止外部带菌空气进入。

4. 在条件较困难的地方,也可以用木制无菌箱代替超净台。无菌箱结构简单,便于移动,箱正面开有两个洞,不操作时用推拉式小门挡住,操作时可以将双臂伸进去。正面上部装有玻璃,便于在内部操作,箱内部装有紫外线灯,从侧面小门可以放进去器具和菌种等。

无菌操作技术当前不仅在微生物学研究和应用上起着举足轻重的作用,而且在许多生物技术中也被广泛应用。例如转基因技术、单克隆抗体技术等。

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